?????? 來源:?Andrew?藥時空 ?????? 在銷售額方面,連續(xù)幾年單克隆抗體藥物在每年的銷售額排名中一直是占據(jù)著前幾名。有不下幾十種新mAb藥物產(chǎn)品和mAb生物仿制藥正在開發(fā)中,并且每一個單抗藥物都需要進行廣泛詳細的表征研究,以獲得臨床試驗所需的批準(zhǔn)并最終投放市場。 ?????? 歐洲藥品管理局(EMA)于2009年7月發(fā)布了有關(guān)mAb表征的監(jiān)管文件。該EMA指南標(biāo)題為“單克隆抗體及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā),生產(chǎn),表征和規(guī)格”。文件指出,研究者應(yīng)詳細的研究單抗的表征mAb。單抗表征應(yīng)包括根據(jù)國際協(xié)調(diào)會議(ICH)指南Q6B(3)確定mAb的理化和結(jié)構(gòu)性質(zhì),純度,雜質(zhì)等方面。 ?????? ICH Q6B為生物技術(shù)產(chǎn)品的表征提供了一套統(tǒng)一的國際公認原則,以支持單抗藥物的市場應(yīng)用。該文件建議進行分析以提供有關(guān)生物或生物制藥產(chǎn)品的以下信息: 結(jié)構(gòu)表征 1 氨基酸序列 2 氨基酸組成 3 末端氨基酸序列 4 肽圖 5 巰基和二硫鍵 6 糖基化結(jié)構(gòu)
理化分析 1 分子量大小 2 異構(gòu)體 3 消光系數(shù)(或摩爾吸收率) 4 電泳圖 5 液相色譜圖 6 光譜
?????? 下面我們一一討論用于提供這些準(zhǔn)則所需數(shù)據(jù)的分析技術(shù)。 ?????? 氨基酸組成和消光系數(shù)測定 ?????? ICH Q6B指出:使用各種水解和分析方法確定氨基酸的總含量,并從所需產(chǎn)品或天然對應(yīng)物的基因序列中推斷出氨基酸組成(如有必要)進行比較。在許多情況下,氨基酸成分分析提供了一些肽和小分子蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息,但是對于大蛋白質(zhì)來說,這些數(shù)據(jù)的確定性通常較差。在許多情況下,氨基酸定量分析數(shù)據(jù)也可用于確定蛋白質(zhì)含量。 ?????? 如今,使用反相高效液相色譜(RP-HPLC)和柱前衍生化技術(shù)進行氨基酸組成分析,或者采用柱后衍生化處理的離子交換色譜法來確定生物制藥產(chǎn)品的氨基酸組成。如果已知每摩爾蛋白質(zhì)的氨基酸摩爾比和蛋白質(zhì)的總分子量,則可以從產(chǎn)物水解物中檢測到的每種氨基酸的量而計算蛋白質(zhì)含量。同樣,如果已知溶液的光密度(在280nm處)(用于分析氨基酸的等分試樣)是已知的,則根據(jù)比爾朗伯定律(吸光度[OD] =ε.cl;其中ε是消光性)系數(shù),c是濃度(M/L)。 ?????? 氨基酸序列和多肽測定 ?????? 對于mAb,EMA指南和ICH Q6B要求通過適當(dāng)?shù)姆椒ǎɡ纾膱D分析,氨基酸測序,質(zhì)譜分析)從DNA序列中推導(dǎo)氨基酸序列,并通過實驗確認DNA衍生序列。另外,N-末端氨基酸序列(是否存在游離氨基酸或焦谷氨酸)和C-末端氨基酸序列(例如,存在或不存在C-末端賴氨酸)的變異性,重鏈等)應(yīng)進行分析。 ?????? 肽圖分析(即使用mAb的特定蛋白酶消化酶,然后使用帶有紫外UV和電噴霧質(zhì)譜檢測[LC/ES–MS的在線RP-HPLC分析產(chǎn)品)可提供有關(guān)分子量的信息。通過選擇的蛋白酶從而使得mAb釋放形成肽。獲得的數(shù)據(jù)能夠提供(或以其他方式)DNA衍生序列的確認,但不能提供mAb輕鏈和重鏈序列的確認。為了在一級氨基酸序列水平上提供確認,需要將許多蛋白酶消化物與在線RP-HPLC和串聯(lián)MS/MS(LC/ES-MS/MS)分析聯(lián)合使用。ICH Q6B實際上并不要求在一級氨基酸水平進行測序。但是,某些監(jiān)管機構(gòu)已采取了相應(yīng)的行動規(guī)范。 ?????? 由于質(zhì)譜的測序無法(在大多數(shù)情況下)區(qū)分異亮氨酸和亮氨酸(這些氨基酸具有相同的分子量),因此要明確分配這兩個氨基酸,就需要對純化的肽在輕鏈和重鏈的可變區(qū)內(nèi)進行自動N端測序。 ?????? 末端氨基酸序列測定 ?????? 進行末端氨基酸分析以鑒定mAb輕鏈和重鏈的氨基和羧基末端氨基酸序列。如果產(chǎn)品顯示一個以上的末端氨基酸序列,則應(yīng)確定末端的相對量。 ?????? 使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離輕鏈和重鏈后自動進行N末端測序,然后常規(guī)地印跡到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,分析mAb輕鏈和重鏈的N-末端?。自動化的N末端測序使用Edman化學(xué)法,在切割N末端和隨后的氨基酸之前,需要在蛋白質(zhì)的N末端具有游離的氨基官能團以進行標(biāo)記。這意味著對于許多mAb(在N端有焦谷氨酸,因此沒有游離氨基),使用此方法的末端測序?qū)⒉惶峁┬蛄行畔ⅰT谶@種情況下,焦谷氨酰胺酶可用于在N末端測序之前酶促除去N末端焦谷氨酸殘基。 ?????? 沒有類似埃德曼化學(xué)法(Edman化學(xué))的完全可靠的方法來確定生物產(chǎn)物的C末端氨基酸序列。可以使用羧肽酶消化或質(zhì)譜圖策略獲得與肽或蛋白質(zhì)C-末端序列有關(guān)的信息。在后一種方法中,可以使用從肽圖獲得的數(shù)據(jù)和產(chǎn)物的完整分子量分析來評估蛋白C末端的完整性或參差不齊的末端存在。 ?????? 巰基和二硫鍵測定 ?????? 在肽圖分析測序分析中,還應(yīng)考慮游離巰基和二硫鍵。用特定蛋白酶消化后的肽圖分析,然后在還原前/還原后使用在線LC/ES-MS或LC/ES-MS/MS分析,可提供全面評估二硫鍵和游離基所需的mAb中的數(shù)據(jù)。在堿性pH值下消化含有游離巰基的蛋白質(zhì)時,必須小心,因為游離硫會在消化液中引發(fā)干擾,因此獲得的結(jié)果可能與產(chǎn)品中真正的二硫鍵/游離巰基譜型不一致。 ?????? 單抗糖基化結(jié)構(gòu)測定 ?????? 由于mAb是糖蛋白,因此還必須表征每種產(chǎn)品的聚糖部分。通常,mAb 在恒定片段(Fc)區(qū)域的每條重鏈中都有一個N鏈聚糖共有序列(天冬酰胺– Xxx –絲氨酸或蘇氨酸,其中Xxx可以是脯氨酸以外的任何氨基酸)。mAb的輕鏈成分通常不會被糖基化。由于額外的N重鏈中可能存在連接的聚糖共有序列,應(yīng)確認是否存在糖基化。ICH Q6B要求:對于糖蛋白,確定碳水化合物含量(中性糖,氨基糖和唾液酸)。此外,碳水化合物鏈的結(jié)構(gòu)多肽鏈,寡糖模式(糖鏈分布)和糖基化位點盡可能分析。 ?????? 如下圖1所示,通常進行單糖成分分析以確定mAb的碳水化合物含量。液相色譜和氣相色譜法(通常采用質(zhì)譜檢測)通常用于定義mAb碳水化合物的含量。所使用的方法應(yīng)允許鑒定和定量中性糖(巖藻糖,甘露糖和半乳糖),氨基糖(N-乙酰氨基葡萄糖,N-乙酰半乳糖胺)和唾液酸(N-乙酰神經(jīng)氨酸和N-羥乙酰神經(jīng)氨酸)水平的產(chǎn)品在內(nèi)。
圖1:用于分析單克隆抗體(mAb)糖基化的正常方法示意圖。LC是液相色譜,MS是質(zhì)譜
?????? 在單糖成分分析之后,下一步分析將進入通常存在于每個重鏈上的寡糖的表征。上圖1顯示了用于從mAb 裂解,純化和分析N-連接聚糖的方法學(xué)示例。 ?????? 還原/烷基化和特定的蛋白酶消化旨在使mAb變性,以便相對較大的酶PNGase F可以有效去除N-連接的聚糖。一旦釋放了N-聚糖,就可以使用簡單的反相色譜柱將親水性聚糖與疏水性更高的肽分離。的N端連接的聚糖餾分可使用質(zhì)譜法或基于液相色譜進行技術(shù)分析。 ?????? 通過分析mAb釋放的N-聚糖(使用圖1中所示的方法)獲得的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI–TOF)質(zhì)譜圖如下圖2所示。觀察到的主要信號與常見的mAb聚糖G0F,G1F和G2F一致(見下圖2)。
圖2:從mAb釋放的N-聚糖的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間(Maldi-TOF)質(zhì)譜分析獲得的原始數(shù)據(jù)。在分析之前將N-聚糖過甲基化
?????? 通過分析從同一mAb產(chǎn)品釋放的N-聚糖獲得的具有脈沖安培檢測(HPAEC-PAD)痕跡的高pH陰離子交換色譜圖如下圖3所示。
圖3:從高pH值陰離子交換色譜法獲得的原始數(shù)據(jù),并通過脈沖安培檢測分析(HPAEC-PAD)測出mAb釋放的N-聚糖
?????? 兩組數(shù)據(jù)都可用于提供所觀察到的N-端連接寡糖的相對定量,并提示存在的N-連接聚糖的結(jié)構(gòu)。糖基化是監(jiān)管機構(gòu)遇到的最常見的翻譯后修飾。監(jiān)管機構(gòu)意識到,即使在制造過程中發(fā)生簡單的變化,例如pH值變化或生長培養(yǎng)基的變化,糖基化也會受到顯著影響。單糖成分分析數(shù)據(jù)(以甘露糖基化,半乳糖基化和唾液酸水平計)監(jiān)管機構(gòu)將通過對各種批次的mAb產(chǎn)品進行分析而獲得的寡糖鏈分析數(shù)據(jù)用作評估制造商是否控制mAb制造過程的一部分。批次之間N-聚糖譜的可比性表明制造過程處于受控狀態(tài)。 ?????? 光譜測定 ?????? EMA和ICH指南還建議,應(yīng)通過適當(dāng)?shù)睦砘椒▉肀碚鱩Ab的更高級結(jié)構(gòu)。ICH Q6B建議使用“圓二色譜,核磁共振(NMR)或其他合適的技術(shù)”。如今,圓二色譜(CD)分析通常用于評估m(xù)Ab的二級結(jié)構(gòu)。從mAb的CD分析獲得的數(shù)據(jù)如下圖4所示。使用CDsstr軟件評估原始數(shù)據(jù)可以估算各種二級結(jié)構(gòu)的相對百分比,如下表I所示。
圖4:從mAb的近紫外(UV)分析獲得的原始數(shù)據(jù)
表I:圖4所示的近UV CD(圓二色譜)數(shù)據(jù)的CDSSTR算法評估結(jié)果
?????? 除了上面概述的結(jié)構(gòu)特征要求外,還需要評估許多其他物理化學(xué)特性。 ?????? 分子量大小 ?????? 使用四極桿飛行時間(Q-TOF)儀器對完整和還原的mAb進行在線LC/ES-MS分析,徹底改變了mAb完整分子量以及釋放的輕鏈和重鏈的測量方法。使用此技術(shù)從mAb的完整分子量分析獲得的數(shù)據(jù)如下圖5所示。
圖5:通過在線電噴霧質(zhì)譜檢測(飛行時間定量)mAb的LC/ES-MS(Q-TOF)分析獲得的去卷積質(zhì)譜
?????? 觀察到的主要峰相距162質(zhì)量單位,這與存在于分子的重鏈上的N-連接的寡糖的半乳糖基化的變化一致。還原后從mAb分析獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下圖6所示。
圖6A:通過mAb在線LC/ES-MS(Q-TOF)分析獲得的去卷積質(zhì)譜
?????? 上圖6A中所示的信號與輕鏈預(yù)期的信號一致,并且下圖6B中觀察到的信號與具有預(yù)期的N-連接寡糖的重鏈預(yù)期的信號一致。除了確定mAb的分子量以及輕鏈和重鏈成分外,這些數(shù)據(jù)還確認了蛋白質(zhì)主鏈的完整性。
圖6B:還原后從mAb在線LC/ES-MS(Q-TOF)分析獲得的去卷積質(zhì)譜
?????? 異構(gòu)體 ?????? 以類似的方式,成像毛細管等電聚焦(cIEF)帶來了革命性的mAb異構(gòu)體分析。cIEF在毛細管柱中是自由溶液的等電聚焦。諸如iCE280分析儀(Convergent Biosciences)之類的專用系統(tǒng)使用整個色譜柱紫外線吸收檢測器來檢測聚焦蛋白區(qū)域,從而避免干擾這些區(qū)域的聚焦。這項技術(shù)的獨特之處在于它具有與傳統(tǒng)凝膠IEF相當(dāng)?shù)姆直媛?,但結(jié)合了基于柱的分離技術(shù)的優(yōu)勢,包括定量(使用280nm的UV)和自動化。 ?????? 從mAb的cIEF分析獲得的原始數(shù)據(jù)如下圖7所示。獲得的數(shù)據(jù)可準(zhǔn)確確定每種異構(gòu)體的pI,并基于UV峰面積對每種異構(gòu)體進行定量。
圖7:單克隆抗體毛細管等電聚焦后獲得的毛細管的UV(280nm)響應(yīng)。
?????? 電泳和液相色譜圖 ?????? 通常使用等電聚焦(如上圖所述),SDS-PAGE(還原前后)和毛細管電泳對mAb進行分析,根據(jù)大小和電荷提供產(chǎn)品分布。 ?????? 使用尺寸排阻色譜法(SEC),RP-HPLC和離子交換液相色譜法進行色譜分析可根據(jù)尺寸,親水性、疏水性和電荷分布提供產(chǎn)品表征分布。 ?????? 電泳和色譜均提供有關(guān)產(chǎn)品身份,均質(zhì)性和純度的信息,并且經(jīng)常用于純化雜質(zhì),使用上述分析技術(shù)進行鑒定和結(jié)構(gòu)表征。 ?????? 蛋白質(zhì)聚集 ?????? 特別是對于mAb,必須使用多種方法評估每種產(chǎn)品中多聚體和聚體的存在。當(dāng)前,監(jiān)管機構(gòu)通常要求使用多角度激光散射(SEC-MALS)和無柱技術(shù)(例如分析離心(AUC))對SEC進行交叉檢查,以對從SEC分析獲得的數(shù)據(jù)進行交叉檢查。 ?????? 由于聚體可能會因與SEC色譜柱的非特異性結(jié)合而丟失,或者實際上可能由于色譜柱上產(chǎn)物的稀釋和剪切力作用而分散,因此需要使用無色譜柱技術(shù)確認SEC結(jié)果。 ?????? 從mAb的SEC-MALS和AUC分析獲得的原始數(shù)據(jù)分別顯示在下圖8和9中顯示。在這種情況下,通過mAb的SEC-MALS分析獲得的數(shù)據(jù)表明存在低水平的聚體(約2.6%)。從AUC分析獲得的數(shù)據(jù)表明存在約5.0%的聚體。通常,使用AUC會比SEC-MALS觀察到更高的聚集水平,這可能是由于可能降低上述分析數(shù)據(jù)中的聚集水平的因素所致。
圖8:通過大小排阻色譜對mAb進行多角度激光散射(SEC-MALS)分析獲得的原始數(shù)據(jù)
圖9:通過mAb的分析離心(SV-AUC)分析獲得的原始數(shù)據(jù)
?????? 結(jié)論 ?????? 本文說明的技術(shù)用于整個產(chǎn)品有效期內(nèi)的臨床前階段,以了解產(chǎn)品,以證明對制造過程的更改(例如按比例放大過程)不會改變產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì),并提供數(shù)據(jù)以證明產(chǎn)品制造的一致性。同樣,越來越多的特征分析技術(shù)(例如肽圖分析和寡糖分析)被用作批放行測試方案的一部分,以將產(chǎn)品放行到臨床中進行試驗并最終投放市場。在開發(fā)任何mAb產(chǎn)品的過程中,至少要進行三批(通常是幾批)的表征分析才能達到上述概述的程度。 ?????? 總而言之,需要一系列分析技術(shù)來充分表征mAb產(chǎn)品。此外,要提交給監(jiān)管機構(gòu),還需要對GLP和cGMP進行分析和驗證?,F(xiàn)在可以在幾周內(nèi)完成根據(jù)EMA和ICH指南對mAb進行全面鑒定,并且儀器的不斷改進使分析實驗室能夠以更高的靈敏度,準(zhǔn)確性和分辨率獲得數(shù)據(jù)。分析的挑戰(zhàn)始終站在這些技術(shù)的最前沿,并納入越來越多的其他適當(dāng)?shù)募夹g(shù),例如傅立葉變換紅外(FT-IR)分析,以補充使用CD和二級結(jié)構(gòu)分析,從而進行適當(dāng)?shù)膮R總和總結(jié)。 ?????? 如涉及知識產(chǎn)權(quán)請與我司聯(lián)系
參考文獻: 1. IMS Midas and Knowledgelink;?http://Pipelinereview.com/, Top 30 biologics 2010, special edition, Jan. 2011,?http://www.pipelinereview.com/free-downloads/TOP_30_Biologics_2010_RDPN_Special_Mar_2011.pdf, accessed April 2011. 2. EMA,?Guideline on Development, Production, Characterization and Specifications for Monoclonal Antibodies and Related Products?(London, Dec. 2008). 3. ICH, Q6B?Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products?(1999).
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