? ? ? ?來源：藥學(xué)速覽 ? ? ? ?小分子共價(jià)抑制劑(covalent inhibitors)也稱不可逆抑制劑(irreversible inhibitors)：是通過共價(jià)鍵與靶蛋白殘基發(fā)生不可逆結(jié)合，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能的一類抑制劑。一般來說，共價(jià)抑制是一個(gè)兩步過程（圖1a）。首先，抑制劑可逆地與靶酶結(jié)合，從而將小分子中的富含電子的化學(xué)彈頭近距離接近酶中的活性殘基。在第二步，抑制劑的兩個(gè)反應(yīng)實(shí)體和酶之間發(fā)生反應(yīng)形成共價(jià)鍵。常見的共價(jià)靶頭有丙烯酰胺、環(huán)氧、氯乙酰基以及氧磺酰氟和磺酰氟等等（圖1b），常見的氨基酸活性殘基有半胱氨酸、絲氨酸、酪氨酸、賴氨酸以及精氨酸和谷氨酸等等（參考文獻(xiàn)1）。 ? ? ? ?相對(duì)可逆抑制劑來說，共價(jià)抑制劑具有較高的生化效率、作用較強(qiáng)并且持久，給藥劑量以及給藥頻率減少、藥效學(xué)與藥代動(dòng)力學(xué)分離，藥物被迅速清除也能夠維持效力、能夠預(yù)防耐藥性的產(chǎn)生、能夠靶向特定蛋白罕見的、非保守殘基，達(dá)到較高的選擇性等特點(diǎn)，但是共價(jià)抑制劑存在脫靶導(dǎo)致的副作用。本文將重點(diǎn)介紹蛋白激酶、RAS蛋白以及其它被廣泛研究的靶蛋白相關(guān)的共價(jià)抑制劑的研究進(jìn)展，進(jìn)而闡述設(shè)計(jì)共價(jià)抑制劑的挑戰(zhàn)和建議。 ? ? ? ?最初發(fā)現(xiàn)的共價(jià)抑制劑是乙酰水楊酸和青霉素。乙酰水楊酸的乙?；鶊F(tuán)可以共價(jià)連接到COX-1上的絲氨酸進(jìn)而抑制活性；青霉素中的β-內(nèi)酰胺可以和轉(zhuǎn)肽酶中活性位點(diǎn)絲氨酸發(fā)生共價(jià)結(jié)合。近年來共價(jià)抑制劑的發(fā)展史如圖2所示。（參考文獻(xiàn)2） ▉ 蛋白激酶類的共價(jià)抑制劑 ? ? ? ?激酶可以將ATP上的γ-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到特定靶分子中的氨基酸殘基上，從而改變蛋白質(zhì)、酶的構(gòu)象和活性。到目前為止,已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)了518種蛋白激酶，這些蛋白激酶的三維結(jié)構(gòu)具有一定的相似性，都有ATP結(jié)合domain，因此可以對(duì)非共價(jià)抑制劑進(jìn)行合理的結(jié)構(gòu)優(yōu)化后引入共價(jià)靶頭從而設(shè)計(jì)高效的共價(jià)抑制劑。 表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的不可逆共價(jià)抑制劑 ? ? ? ?EGFR屬于受體酪氨酸激酶家族，通過催化蛋白酪氨酸磷酸化控制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是一種細(xì)胞表面蛋白，可以結(jié)合其天然的配體進(jìn)而誘導(dǎo)酪氨酸自磷酸化和信號(hào)細(xì)胞增殖。該基因的特定突變與非小細(xì)胞肺癌有關(guān)(NSCLC)。最常見的是19外顯子缺失(DE746-A750)和一個(gè)單點(diǎn)突變，L858R。這些被稱為“激活突變”，因?yàn)樗鼈儗?dǎo)致配體非依賴的酪氨酸激酶活性。 ? ? ? ?非正常升高的激酶活性可以被ATP競(jìng)爭(zhēng)性可逆藥物抑制，如吉非替尼和厄洛替尼可以抑制激酶活性水平(圖3a)。然而，另一個(gè)活性位點(diǎn)突變T790M降低了它們的至少50%的功效。近年來報(bào)道了一些不可逆抑制劑如PD168393，PF00299804 (dacomitinib)、和EKB569 (pelitinib)(圖3b)均有報(bào)道，但并不能成功克服與T790M突變相關(guān)的藥物療效問題。Neratinib可以和C797進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，但由于其生物利用度不高以及腹瀉的副作用而沒有進(jìn)一步的研究。Afatinib是一種ErbB家族抑制劑劑，是FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)EGFR共價(jià)抑制劑。單獨(dú)使用阿法替尼延長(zhǎng)無進(jìn)展生存(PFS)時(shí)間幾乎是安慰劑聯(lián)合治療患者的3倍，當(dāng)使用西妥昔單抗聯(lián)合治療，對(duì)L858R / T790M erlotinib-resistant腫瘤也產(chǎn)生不錯(cuò)的效果，但會(huì)引起皮疹和腹瀉的副作用。 ? ? ? ?為了減輕副作用，科學(xué)家們?cè)O(shè)計(jì)了三代共價(jià)抑制劑，WZ4002可以與C797形成共價(jià)連接，且嘧啶環(huán)上的氯可以與790位甲硫氨酸形成鹵鍵，這個(gè)相互作用增加了化合物對(duì)EGFR(T790M)的選擇性。此外2015年11月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了由阿斯利康開發(fā)的TAGRISSOTM(奧希替尼，原名AZD9291)圖4b)，用來治療晚期NSCLC。臨床前研究表明IC50值為對(duì)L858R突變體的活性為12 nM，對(duì)L858R/T790M EGFR雙突變體的活性為1 nM，該藥物對(duì)EGFR L858R/T790M表現(xiàn)出約200倍的效力。 Bruton’s tyrosine kinase (BTK)的不可逆共價(jià)抑制劑 ? ? ? ?布魯頓酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase，BTK）是胞漿內(nèi)非受體型酪氨酸激酶TEC家族中的一員，在B細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、增殖分化過程中起著重要作用，同時(shí)也是B細(xì)胞惡性腫瘤的治療靶點(diǎn)，BTK突變導(dǎo)致一種免疫缺陷疾病—X-連鎖無丙種球蛋白血癥（X-linked agammaglobulinemia，XLA）。Ibrutinib(原名PCI32765，見圖5a)是一種共價(jià)BTK抑制劑，它被批準(zhǔn)用于治療慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)和瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥。Ibrutinib通過減少Y223殘基上的自磷酸化來抑制BTK。其丙烯酰胺部分與C481反應(yīng)形成BTK中的共價(jià)鍵激酶結(jié)構(gòu)域，它將BTK鎖定在變構(gòu)抑制狀態(tài)，雖然它在治療B細(xì)胞淋巴瘤和白血病上很成功，ibrutinib會(huì)導(dǎo)致副作用，如出血，皮疹，腹瀉，心房顫動(dòng)。為了克服副作用，科學(xué)家們?cè)O(shè)計(jì)了幾個(gè)第二代BTK抑制劑（圖5d），其中一種抑制劑，阿卡拉替尼(acalabrutinib，圖5c)，顯示效力強(qiáng)，口服吸收快，短半衰期以及減少與EGFR和其他Tec家族蛋白的結(jié)合。 不可逆的p90核糖體S6激酶不可逆共價(jià)抑制劑(RSKs) ? ? ? ?p90核糖體S6激酶（RSK）家族是由絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路激活的一種蛋白激酶，在黑色素瘤生長(zhǎng)和增殖中起關(guān)鍵作用。根據(jù)RSK非共價(jià)抑制劑PP1以及蛋白共晶結(jié)構(gòu)，利用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)合成了RSK不可逆共價(jià)抑制劑FMK，意外發(fā)現(xiàn)FMK對(duì)大量激酶都有作用，此外2018年Gothelf, Nissen等人設(shè)計(jì)了化合物富馬酸二甲酯，發(fā)現(xiàn)其是MSKs的變構(gòu)共價(jià)抑制劑（圖6）。 蛋白激酶的可逆共價(jià)抑制劑 ? ? ? ?可逆共價(jià)抑制劑的結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制與不可逆共價(jià)抑制劑均相似, 而不同的是其與目標(biāo)靶蛋白的共價(jià)結(jié)合是可逆的(圖7).可逆共價(jià)抑制劑的親電彈頭多為氰基、酮羰基等可逆親核加成反應(yīng)受體.而其與靶標(biāo)共價(jià)結(jié)合的可逆性, 使得可逆共價(jià)抑制劑的藥代動(dòng)力學(xué)特征介于不可逆共價(jià)抑制劑和非共價(jià)抑制劑之間?？赡婀矁r(jià)抑制劑在一定程度上繼承了不可逆共價(jià)抑制劑作用時(shí)間長(zhǎng)、有效濃度低等優(yōu)點(diǎn), 同時(shí)也減少了脫靶帶來的毒性風(fēng)險(xiǎn)。 ? ? ? ?Taunton及其同事成功地開發(fā)了高反應(yīng)性的2-氰基丙烯酸酯基RSK2可逆共價(jià)抑制劑 (圖8a)，此外也有一系列可與BTK 的Cys481發(fā)生可逆結(jié)合的共價(jià)抑制劑（圖8b） ▉ RAS家族的共價(jià)抑制劑 ? ? ? ?RAS癌基因參與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展，自82年Weinberg等人發(fā)現(xiàn)其中有活化的H-ras基因后，引起了人們對(duì)RAS癌基因在人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展中所起作用的極大關(guān)注。經(jīng)十余年研究認(rèn)為，RAS癌基因參與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的調(diào)控，參與多種腫瘤的形成與發(fā)展。迄今為止，對(duì)于RAS癌基因突變，還沒有有效的治療方法。然而，最近關(guān)于開發(fā)RAS蛋白的強(qiáng)效小共價(jià)抑制劑的報(bào)道又重新燃起了人們對(duì)這些所謂的“不可成藥”蛋白質(zhì)的希望 KRAS突變體的共價(jià)抑制劑 ? ? ? ?KRAS蛋白是由 KRAS 基因編碼的一種小 GTP 酶，它屬于 RAS 超蛋白家族，是細(xì)胞生長(zhǎng)的重要調(diào)節(jié)蛋白，一旦 KRAS 被激活后，可以激活多條信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。 ? ? ? ?KRAS 是實(shí)體瘤中最常見的癌基因之一，大約 30% 的腫瘤都存在 KRAS 突變，包括 90% 的胰腺癌，50% 的結(jié)腸癌和 25% 的肺癌。最常發(fā)生基因突變的位點(diǎn)是第 12、13 和 61 位密碼子，其中以 12 位密碼子的突變最為常見。最近，Shokat和同事報(bào)道了一組半胱氨酸反應(yīng)抑制劑，它們與KRAS G12C突變體相互作用，隨后與G12C形成共價(jià)加合物（圖9a），此外他們篩選了其它親電試劑，例如丙烯酰胺和乙烯基磺胺，它們與G12C殘基形成不可逆的共價(jià)鍵(圖9c,e)。 ▉ 其它蛋白的共價(jià)抑制劑 乙酰膽堿酯酶的共價(jià)抑制劑 ? ? ? ?乙酰膽堿是一種刺激膽堿能的神經(jīng)遞質(zhì)，阿爾茲海默患者中乙酰膽堿受體降低，抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)是目前治療阿爾茨海默氏病(AD)最有效的方法。Rivastigmine可以共價(jià)的結(jié)合在乙酰膽堿酯酶上，從共晶結(jié)構(gòu)上可以看出，S203(酯位)和E202(陰離子位)與化合物有相互作用，Rivastigmine的氨基甲?；挥诨钚圆课坏慕z氨酸附近，與絲氨酸發(fā)生共價(jià)結(jié)合后釋放出一個(gè)酚類化合物（圖10）。 組織蛋白酶的共價(jià)抑制劑 ? ? ? ?組織蛋白酶是一組半胱氨酸蛋白酶，參與溶酶體的蛋白水解，并控制多種細(xì)胞信號(hào)通路。在人類中編碼有11種組織蛋白酶（B, C, F, H，K, L, O, S, V, W，和X）這些酶的過度活躍通常與疾病發(fā)展有關(guān)。 ? ? ? ?在不同的組織蛋白酶中，CatK一直備受關(guān)注。在破骨細(xì)胞中含量豐富，在骨吸收和骨重塑中起重要作用。因此，它已經(jīng)成為治療骨質(zhì)疏松癥的藥物靶點(diǎn)。與其他組織蛋白酶相比，Balicatib對(duì)CatK有很大的選擇性，但因?yàn)閷?dǎo)致一些患者出現(xiàn)嗎啡樣皮膚病變因此在II期臨床研究后停用。在許多CatK的共價(jià)抑制劑，odonacatib，達(dá)到了III期試驗(yàn)(圖11b)，Odonacatib含有一個(gè)丁腈基團(tuán)，可與CatK to的C25發(fā)生反應(yīng)形成亞氨基硫酯加合物(圖11c)。 ▉ 總結(jié)與展望 ? ? ? ?盡管在治療疾病的歷史中，共價(jià)抑制劑并不是很受歡迎，除了潛在的毒性和脫靶等缺點(diǎn)外，共價(jià)抑制劑發(fā)揮作用依賴于靶蛋白或者受體中的單一氨基酸殘基，如果此氨基酸發(fā)生突變，則會(huì)產(chǎn)生耐藥性，但共價(jià)抑制劑作用較強(qiáng)并且持久，可以降低給藥劑量以及給藥頻率，特別是共價(jià)抑制劑有可能作用于傳統(tǒng)的不可成藥的靶蛋白（例如KRAS），因此共價(jià)抑制劑將具有很好的發(fā)展前景，期待有更多的共價(jià)抑制劑上市。 ? ? ??如涉及知識(shí)產(chǎn)權(quán)請(qǐng)與我司聯(lián)系
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