? 來源：生物制品圈

雙特異性抗體與T細胞重定向

使用雙特異性抗體分子進行T細胞重定向，是非常有前景的腫瘤治療策略。

雙特異性抗體，約50%為CD3靶向的雙特異性抗體（BsAb），包括catumaxomab (Removab?, Epcam x CD3, Trion Research GmbH,approved in the European Union in 2009),銜接T細胞的雙特異性抗體（BiTE）blinatumomab (Blincyto?, CD19xCD3,Micromet/Amgen, approved by the US Food and Drug Adiministration in 2015）。50kDaBiTE被設計成在一個多肽鏈中有兩個單鏈可變片段(ScFv)結(jié)構(gòu)域。此外，正在研究從納米抗體(25 KDa)到IgG-融合(≥150 kDa)的多種形式。

雖然較小的分子具有連接細胞間距離較短的優(yōu)點，并且可以顯示更好的腫瘤穿透性，但需要進行Fc改造，通過FcRn介導的循環(huán)和調(diào)節(jié)Fc活性來控制血清的半衰期。?

T細胞殺傷活性需要形成免疫突觸（ISs），是將T細胞鏈接到呈遞有多肽-MHC復合物的目標細胞。激活的的免疫突觸，導致釋放的細胞毒性顆粒和細胞因子.由于空間鄰近T細胞和靶細胞在ISs形成過程中，大分子如CD45被排除在膜間之外空間。這允許細胞間距離為15 nm，與IgG 1的Fab臂的距離大致相同。

使用BsAb的T細胞重定向需要模仿IS，這是通過與靶細胞表面抗原結(jié)合的CD3與靶細胞結(jié)合來橋接T細胞受體復合物來實現(xiàn)的。多種因素可以影響T細胞重定向活動，如靶向臂的差異親和力，如CLL1xCD3 knob-in-hole IgG1BsAb的例子所示。MCSPxCD3 BiTE和FcRH5xCD3BsAb的表位結(jié)合距離也很重要。

在針對5T4膜近端結(jié)構(gòu)域的T細胞上，在嵌合免疫受體(CIR)的胞外部分插入Fc-based linker也能增強T細胞的活化和靶細胞殺傷。相反，在沒有Fc-based linker情況下，表達CIR時，針對CD19的T細胞被激活到更高的水平，但沒有更有效地殺傷靶細胞。因此，結(jié)構(gòu)特征，如與膜的抗原表位的可及性和距離以及bsAb的靈活性，對有效的T細胞重定向有重要影響。

IgG亞型結(jié)構(gòu)差別

BsAb的IgG亞型也會由于可變區(qū)域展示、鉸鏈序列和二硫鍵結(jié)構(gòu)的變化而影響其功能活性。IgG的鉸鏈區(qū)連接Fc結(jié)構(gòu)域和Fab結(jié)構(gòu)域，每個IgG亞類的長度、序列和二硫鍵結(jié)構(gòu)各不相同。

IgG1具有較長的鉸鏈區(qū)，有兩個二硫鍵。IgG2的鉸鏈區(qū)最短，也是最堅硬的，因為它存在于三個主要異構(gòu)體中的四個二硫鍵。IgG4的鉸鏈與IgG2的鉸鏈區(qū)氨基酸長度相同（12個氨基酸），但含有更多的脯氨酸，而不是半胱氨酸殘基，并且只有一個類似IgG1的二硫鍵結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)變化影響著IgG鉸鏈區(qū)的柔韌性，IgG1>IgG4>IgG2。IgG1是柔韌性最好的（由電子顯微鏡觀測）。用小角度X射線散射(SAXS)分析不同IgG亞bAb結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象。IgG1分子是封閉Y、中間Y/T和廣泛開放T構(gòu)象的等量混合物。IgG4分子以Y/T構(gòu)象為主，而IgG 2分子以Y構(gòu)象為主。盡管IgG1、IgG2和IgG4亞型被用作治療生物制劑的框架,IgG亞型對T細胞重定向的影響未詳細研究。

IgG亞型對T細胞重定向研究

分子設計

Janssen BioTherapeutics的科學家，通過controlled Fab-arm exchange (cFAE)技術(shù)，建立IgG1，IgG2，IgG4三種亞型的CD3XCD19雙特異性抗體。結(jié)合CD19膜遠端結(jié)構(gòu)域的親本抗體是以人源化的blinatumomab（博納吐單抗）為基礎的，結(jié)合CD3e鏈的親本抗體是基于OKT3的可變區(qū)。為了盡可能減少Fcγ受體（FcγR）的影響，采用Fc突變，減少其與FcγR的結(jié)合：IgG1 FES, IgG2 σ1and IgG4 PAA。

設計兩個IgG亞型，將IgG1和IgG4的F（ab）2包含鉸鏈區(qū)融合到IgG2 σ1-Fc (命名為 IgG1:2 σ1 and IgG4:2 σ1）。

所有亞型的蛋白質(zhì)和細胞結(jié)合通過SPR和流式細胞術(shù)來進行。BsAb能將T細胞連接到其各自的靶細胞，并抑制靶細胞的增殖，以此評價其體外活性。

試驗數(shù)據(jù)

1.?各亞型雙特性抗體分子質(zhì)量控制

RSV：specificity control

2.?各亞型BsAb和Fc受體的結(jié)合能力

FcRn結(jié)合不受影響，因而對藥物血液半衰期沒有影響。所有由IgG2σ1 Fc組成的分子與FcγRs相互作用最少。在抗體依賴細胞介導的細胞毒性、補體介導的細胞毒性和抗體依賴的細胞吞噬作用等多種體外功能試驗中，IgG 2σ1與FcγRs的相互作用有限，在體外轉(zhuǎn)化為低活性或無活性。

3.?各亞型BsAb和抗原、CD19B細胞淋巴瘤、T細胞結(jié)合力

HBL-1：CD19-expressing B-cell lymphoma lines (low CD19 receptor density(RD)

Daudi：(high CD19 RD)

所有分子單臂親和力<3X范圍內(nèi)，表明IgG亞類和分子形式(抗體與BsAb)對體外親和力均無顯著影響。同樣，CD19各IgG亞類細胞結(jié)合是平等的，與CD19RD和RFP-轉(zhuǎn)導無關(guān).由于二價IgGs比與BsAb的結(jié)合弱2-3倍，這些觀察表明分子的親和力很小。相反，CD3特異性BsAb結(jié)合T細胞的能力比他們的雙價親本抗體弱10倍，提示CD3的親和力比CD19更強。這可能是由抗原本身驅(qū)動的，特別是特定的抗原表位，它們允許CD3的二價結(jié)合，而不是CD19的二價結(jié)合。

4. 各抗體亞型細胞聚合能力

5. 各IgG亞型抑制B細胞淋巴瘤增殖能力?

概括

雙特異性抗體(BsAbs)介導的T細胞重定向是一種很有前途的腫瘤治療方法。雙重抗原結(jié)合對T細胞的重定向是必需的，并受依賴于其IgG亞類的BsAb的結(jié)構(gòu)特性的影響。在本研究中，針對CD19xCD3的BsAb是在攜帶Fc突變的IgG1、IgG2和IgG4的變異體中產(chǎn)生的，它們減少了FcγR的相互作用（避免CDC，ADCC等副作用），兩種嵌合IgG亞型為IgG 1：2和IgG 4：2，其中IgG 1-或IgG 4-F(Ab)2被嫁接在IgG 2 Fc上。含有IgG 2或IgG 4-F(Ab)2結(jié)構(gòu)域的分子是結(jié)構(gòu)最緊密的分子。所有的BsAb都被證明與它們的目標蛋白(和相應的細胞)結(jié)合得同樣好。然而，CD19xCD3?IgG 2不能同時結(jié)合這兩種抗原，這是由于T細胞沒有與靶細胞聚集。這意味著IgG2 BsAb在T細胞重定向試驗中的作用減弱.IgG 4：2和IgG 1：2嵌合亞型IgG2BsAb的活性完全恢復。這證實了F(Ab)2區(qū)對BsAb功能活性的重要貢獻，表明不同F(xiàn)c和F(Ab)2結(jié)構(gòu)域的工程改造分子可以調(diào)控BsAb的功能。?

核心內(nèi)容總結(jié)

IgG2型因為鉸鏈區(qū)短且柔韌性差，如果整體雙特異性抗體亞型為IgG2，則T細胞的重定向效果最差。但IgG2型Fc和FcγRs結(jié)合最弱，可以引起最小的毒副作用。

將IgG1和IgG4含鉸鏈區(qū)的F（ab）2和IgG2的Fc段連接成嵌合分子，則可以將T細胞重定向和最小毒副作用兩個優(yōu)勢結(jié)合在一起。并且減少使用突變技術(shù)改造Fc段，因為有研究報道突變，可以改變抗體藥物的免疫毒性，引起臨床毒性反應。采用IgG2天然的Fc段可以一定程度解決這個問題。?

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