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基于MABEL approach的雙特異性抗體人體首次給藥(FIH)劑量計算
2020-10-15 訪問次數(shù):6086
? ? ? ?如何確定新藥人體內(nèi)首次給藥(first in human,F(xiàn)IH)劑量是新藥研究過程中的重要環(huán)節(jié)之一,在臨床實驗的過程中,F(xiàn)IH劑量代表著臨床實驗的起點,因此必須絕對安全。在FDA的指導(dǎo)方案中,F(xiàn)IH可以通過在相關(guān)物種上進行的多種藥理、毒理研究得出的,“未觀察到不良反應(yīng)水平”(No Observable Adverse Effect Level,NOAEL)確定,此概念一般認為是臨床前藥理毒理實驗中,在相關(guān)物種上確定的最大安全劑量。通過物種敏感度、特異性及人體適用性等相關(guān)因素可以確定NOAEL的人體等效劑量(human equivalent dose,HED),再加上特定的安全系數(shù)(safety factor)計算得出人體最大安全起始劑量(human maximum recommended safe starting dose,MRSD)。然而,能夠高度激活免疫系統(tǒng)的生物藥物,即使在低劑量下也可能會引起諸如細胞因子釋放綜合征、神經(jīng)系統(tǒng)毒性等強烈的副作用。
? ? ? ?在TGN1412,CD28超級激動劑臨床實驗Ⅰ期“慘案”過后,為了提高臨床實驗的安全性,EMA和FDA在2007年發(fā)布了針對生物藥FIH確立的具體指導(dǎo)方針,其中強調(diào)了包括雙特異性抗體在內(nèi)的一系列藥物的FIH計算,應(yīng)該基于“最小預(yù)期生物效應(yīng)級別”(minimum anticipated biological effect level,MABEL),此概念認為是在人體中可以被認為有生物學(xué)效果的最小劑量。
? ? ? ?近日,來自杜克大學(xué)的學(xué)者在《Journal for Immunotherapy of Cancer》上發(fā)表的文章,詳細分享了通過MABEL方法計算他們設(shè)計的一種用于治療膠質(zhì)母細胞瘤的EGFRvⅢ-CD3雙特異性抗體(EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv)MRSD的方法,同時驗證了通過此方法計算得出的FIH劑量在人外周血CD3的理論受體占有率(Theoretical receptor occupancy),來確定這一FIH劑量的安全性。

? ? ? ?在本文中,MABEL的計算應(yīng)用了體外、體內(nèi)藥代動力學(xué)/藥效學(xué)(PK/PD)的數(shù)據(jù),包括:在人類與相關(guān)物種體內(nèi)靶細胞上的靶標結(jié)合及受體占有率;人類與相關(guān)物種靶細胞上的濃度-反應(yīng)(concentration-response)曲線;相關(guān)物種體內(nèi)的劑量/暴露-反應(yīng)(dose/exposure-response)曲線等。

EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv與血細胞的結(jié)合

? ? ? ?研究者使用了流式細胞法,分別檢測了EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv雙特異性抗體與人、比格犬、CD-1小鼠、食蟹猴、Sprague Dawley大鼠、新西蘭白兔和豬的外周血單個核細胞(PBMC)的結(jié)合能力,來評估EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv在細胞水平上與CD3ε的親和力。實驗結(jié)果顯示(圖1),EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv只與人的PBMC結(jié)合,與其他種類動物的PBMC不結(jié)合。與人PBMC結(jié)合的EC20為150ng/mL。

圖1 流式細胞法檢測,在人及相關(guān)物種(食蟹猴、比格犬、小鼠、新西蘭白兔、大鼠)的PBMC中,EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv 只與人的PBMC結(jié)合,且EC20為150ng/mL

EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv與腫瘤細胞的結(jié)合

? ? ? ?使用流式細胞法,分別檢測了EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv與野生型人膠質(zhì)瘤細胞系U87-MG(不表達EGFRvⅢ)及U87-MG-EGFRvⅢ穩(wěn)轉(zhuǎn)腫瘤細胞系(表達EGFRvⅢ)的結(jié)合,用以評估EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv與EGFRvⅢ在細胞水平上的結(jié)合能力。結(jié)果如圖2,EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv與U87-MG-EGFRvⅢ穩(wěn)轉(zhuǎn)腫瘤細胞系結(jié)合的EC20 為10307 ng/mL,與野生型U87-MG細胞系基本無結(jié)合。

圖2流式細胞法檢測,EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv與EGFRvⅢ高表達腫瘤細胞系結(jié)合的EC20 為10307 ng/mL

細胞因子釋放實驗

? ? ? ?使用Luminex multiplex platform,分別在PBMC單獨存在、PBMC+ U87-MG-EGFRvⅢ細胞(EGFRvⅢ+)、PBMC+ U87-MG細胞(EGFRvⅢ-)條件下,對hEGFRvIII-CD3 bi-scFv介導(dǎo)的人PBMC細胞因子釋放進行了檢測,使用PMA作為陽性對照。結(jié)果顯示(圖3),hEGFRvIII-CD3 bi-scFv介導(dǎo)人CD3+的細胞產(chǎn)生細胞因子的釋放量具有腫瘤抗原依賴性和劑量依賴性,在無EGFRvⅢ抗原存在的情況下,EGFRvIII-CD3 bi-scFv無法誘導(dǎo)細胞因子釋放;在有EGFRvⅢ存在的情況下,EGFRvIII-CD3 bi-scFv誘導(dǎo)人PBMC細胞因子IFN-?、IL-6、MIP-1α、GM-CSF和TNFα釋放的EC20分別為42.3、12.5、14.7、27.6和16.5 ng/mL。

圖3 hEGFRvIII-CD3 bi-scFv介導(dǎo)的人PBMC細胞因子釋放呈抗原依賴效應(yīng)及劑量依賴效應(yīng)

T細胞激活和增殖實驗

? ? ? ?將EGFRvIII-CD3 bi-scFv在存在腫瘤抗原(U87-MG-EGFRvⅢ)或不存在腫瘤抗原(U87-MG)的條件下與人PBMC共同孵育5天,分別通過檢測CD25+T細胞的表達量和CFSE標記細胞的比例來評估EGFRvIII-CD3 bi-scFv激活T細胞及誘導(dǎo)T細胞增殖的能力。結(jié)果顯示,EGFRvIII-CD3 bi-scFv介導(dǎo)的T細胞激活及T細胞增殖具有抗原特異性和劑量依賴效應(yīng)。在EGFRvⅢ存在的體系中,EGFRvIII-CD3 bi-scFv激活T細胞和介導(dǎo)T細胞增殖的EC20分別為1021ng/mL、70.2 ng/mL。

圖4 EGFRvIII-CD3 bi-scFv在EGFRvIII+體系中介導(dǎo)T細胞激活的EC20為1021ng/mL為,介導(dǎo)T細胞增殖的EC20為70.2 ng/mL

腫瘤細胞殺傷實驗

? ? ? ?使用鉻釋放測定法,分別檢測了EGFRvIII-CD3 bi-scFv對U87-MG-EGFRvⅢ細胞和U87細胞的殺傷效果,效靶比為20:1。結(jié)果顯示,EGFRvIII-CD3 bi-scFv對U87-MG-EGFRvⅢ細胞的殺傷效果具有劑量依賴效應(yīng),EC20為1.34 ng/mL;對U87野生型細胞幾乎無殺傷作用。

圖5 EGFRvIII-CD3 bi-scFv對腫瘤細胞的殺傷效果具有腫瘤抗原特異性

? ? ? ?以上全部體外實驗結(jié)果匯總?cè)绫?所示,按照每種體外實驗的20%藥理活性濃度(20% of the maximal effective concentration,EC20),基于人平均血漿容積為3L、患者平均體重為70kg計算人體初始給藥劑量(MRSD)。本系列實驗中,最低的EC20來自于腫瘤細胞毒性實驗(1.34 ng/mL),相當于每位患者4020 ng或 57.4 ng/kg的起始劑量。

表1 體外實驗測定的EC20值及對應(yīng)的HED值

小鼠體內(nèi)重復(fù)給藥、單次給藥毒性實驗

? ? ? ?研究人員分別在NSG-人PBMC免疫重建小鼠模型和CD3人源化小鼠模型上進行了體內(nèi)毒性實驗。在移植了U87-MG-EGFRvⅢ膠質(zhì)瘤細胞和人PBMC的NSG免疫缺陷小鼠中,EGFRvIII-CD3 bi-scFv的給藥劑量為2.5 mg/kg,經(jīng)尾靜脈連續(xù)給藥5天,每日一次。結(jié)果顯示,給藥組的小鼠生存率較溶劑對照組有顯著性延長(圖6,P=0.0079),證明EGFRvIII-CD3 bi-scFv在此模型上不具有毒性。
? ? ? ?在CD3人源化小鼠模型中,研究人員也測試了EGFRvIII-CD3 bi-scFv單次給藥10 mg/kg的劑量,同樣未觀察到顯著的毒性反應(yīng)(數(shù)據(jù)未給出)。此數(shù)據(jù)結(jié)合該實驗室往次實驗結(jié)果表明,在嚙齒動物模型上,每日2.5 mg/kg的給藥劑量為安全有效劑量。

圖6 EGFRvIII-CD3 bi-scFv在U87-MG-EGFRvⅢ/PBMC-NSG鼠移植模型上可顯著提高小鼠生存率

體內(nèi)有效、安全劑量計算

? ? ? ?基于嚙齒類模型中每日2.5 mg/kg的安全有效給藥劑量,計算人體等效劑量。公式為

CLhu:預(yù)期人體清除率;Ceff,ss:預(yù)測穩(wěn)態(tài)下有效濃度;Tau:給藥間隔
? ? ? ?hEGFRvIII-CD3 bi-scFv的結(jié)構(gòu)與博納吐單抗(Blinatumomab,Blincyto,CD3-CD19雙特異性抗體,2014年美國上市)類似,博納吐單抗在成年人體內(nèi)的清楚速率為43 mL/h/kg,因此研究者選用這個數(shù)據(jù)作為CLhu的參考。Ceff,ss為在hCD3轉(zhuǎn)基因小鼠中以5 mg/kg劑量測得的PK數(shù)據(jù)(0.583 μg/mL)。給藥間隔Tau為24小時。
? ? ? ?根據(jù)此公式,計算出的人體等效劑量為0.6mg/kg,而由體外實驗數(shù)據(jù)計算得出的MABEL劑量為57.4ng/kg,較嚙齒類動物模型上藥效數(shù)據(jù)計算出的劑量低10400倍。證實了此劑量(57.4ng/kg)在動物模型上的安全性。

受體占有率計算

? ? ? ?靶抗原的理論占有率(receptor occupancy,RO)是藥物臨床起始劑量選擇的重要因素之一。TGN1412 FIH的選擇,0.1mg/kg的劑量換算得出的人體外周血中的RO約為90%,對于激動劑而言可能過高。在本文中,研究人員根據(jù)兩個不同的公式評估了基于MABEL方法計算得出的hEGFRvIII-CD3 bi-scFv給藥劑量(57.4ng/kg)在人體中的理論受體占有率,如下所示:
? ? ? ?公式1:

? ? ? ?公式1基于米氏方程(Michaelis-Menten equilibrium),其中RO為受體占有率,Ab為抗體起始濃度(引用細胞毒性實驗EC20,1.34 ng/mL或26.3pM),KD為藥物對應(yīng)抗原的平衡解離常數(shù)。
? ? ? ?公式2:

? ? ? ?公式2為公式1的升級版,由于在已知體系中存在大量靶受體的情況下,由米氏方程計算出的RO可能不準確,因此選用公式2進行RO的計算。其中RO為受體占有率,KD為藥物對應(yīng)抗原的平衡解離常數(shù),TD為總藥物濃度(對應(yīng)細胞毒性實驗EC20,1.34 ng/mL或26.3pM),TT為總目標濃度。
? ? ? ?TT的計算方法為:

? ? ? ?其中n1為每個細胞上CD3受體的數(shù)目(6.11×104),n2為每體積中T細胞的數(shù)目(1.3×109 L?1),NA為阿伏伽德羅常數(shù)。
? ? ? ?由公式2計算得出的MABEL劑量的理論受體占有率(引用與CD3ε結(jié)合的KD和細胞毒性實驗的EC20)為0.17%。對于激動劑而言,根據(jù)已知藥理學(xué)和臨床前實驗的經(jīng)驗,可接受的RO數(shù)據(jù)上限約為10%,本研究中基于MABEL劑量計算得出的RO的數(shù)據(jù)遠低于這一限度。但研究人員也說明了這種方法的限制性,由于hEGFRvIII-CD3 bi-scFv為雙特異性抗體,該方法無法計算藥物同時與表達于不同細胞上的靶抗原(EGFRvIII于腫瘤細胞,CD3于T細胞)結(jié)合的理論受體占有率。
? ? ? ?本文詳細地介紹了一種激動劑型雙特異性抗體基于MABEL方法計算FIH的過程及實驗思路,通過對比MABEL劑量與臨床前體內(nèi)等效劑量,確定了這種方法的安全性,對于激動型抗體藥物的FIH計算具有一定的參考價值。
? ? ? ?原創(chuàng)內(nèi)容未經(jīng)授權(quán),禁止轉(zhuǎn)載至其他平臺。

參考文獻
Schaller, Teilo H., et al. "First in human dose calculation of a single-chain bispecific antibody targeting glioma using the MABEL approach." Journal for Immunotherapy of Cancer 8.1 (2020).


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