? ? ? ?近期“生物世界”的一篇原創(chuàng)文章，介紹了Cell在今年2月15日發(fā)布的“Inhibitory CD161 receptor identified in glioma-infiltrating T cells by single-cell analysis”（圖1）。這篇論文的高光之處在于，單細(xì)胞在組織內(nèi)成像的技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞級別的蛋白表達(dá)檢測。并且，文中提出了類似于免疫治療的思路，將CD161視為潛在的治療靶點(diǎn)，阻斷CD161以激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞（圖2）。 圖1 Cell最近發(fā)布的關(guān)于CD161的文章。高光之一：高技術(shù)，單細(xì)胞級別檢測CD161在T細(xì)胞的表達(dá)，這些T細(xì)胞滲透進(jìn)入了神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織。 圖2 高光之二：證明機(jī)制，具有細(xì)胞毒性的T細(xì)胞，也表達(dá)多種NK細(xì)胞受體。其中NK細(xì)胞表達(dá)的抑制型受體CD161，在T細(xì)胞也有表達(dá)，通過結(jié)合免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞表達(dá)的CLEC2D，體現(xiàn)抑制活性。通過阻斷CD161與CLEC2D的結(jié)合，可以激活T細(xì)胞的活性。
一、給你一張過去的CD ? ? ? ?CD161，別名NKRP1A（NK受體P1A）、KLRB1、CLEC5D，以下均稱為CD161。其中，KLRB1（killer cell lectin-like receptor subfamily B1）是推薦的名稱，中文翻譯為“殺傷細(xì)胞的類凝集素受體亞家族B成員1號(hào)”。CD161目前只發(fā)現(xiàn)一種序列，沒有其他變體。 ? ? ? ?LLT1，別名CLEC2D（前言的Cell所稱），以下均稱為LLT1，作為CD161的配體。LLT1（lectin-like transcript 1）為CLEC2D的1號(hào)變體，中文翻譯“類凝集素轉(zhuǎn)錄體1”。這意味著CLEC2D存在多個(gè)變體，其中只有變體1，即LLT1，具有結(jié)合CD161的能力，且能夠激活下游信號(hào)。其他變體，比如變體2、4，不結(jié)合CD161。 ? ? ? ?CLEC，C-type lectin domain family，可見CD161和LLT1同屬于這個(gè)大家族，分屬不同的亞家族。 ? ? ? ?CD161和LLT1的表達(dá) ? ? ? ?CD161主要表達(dá)于粒細(xì)胞，以及單個(gè)核細(xì)胞的表面（圖3A），表達(dá)特異性較好。單個(gè)核細(xì)胞，包括NK細(xì)胞和T細(xì)胞，其中T細(xì)胞包括Th17、NK T、記憶T細(xì)胞，但不包括原始T細(xì)胞（圖3B）。另外，IL-17的表達(dá)與CD161的表達(dá)有極大的相關(guān)性，比如CD4+ TCRαβ+、CD8+ TCRαβ+、CD4-CD8- TCRαβ+、CD4-CD8-TCRγδ+等產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞，它們存在CD161表達(dá)。另外，CD161+的細(xì)胞，IL-23R和RORC的表達(dá)量顯著高于CD161-的細(xì)胞。 ? ? ? ?LLT1主要表達(dá)在小腸的派爾淋巴結(jié)，以及粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞（包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞）、扁桃體、肺、腎上腺、腎等部位（圖3C）。外周循環(huán)的B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞，在靜息狀態(tài)下，不表達(dá)LLT1，但是激活后，比如TLR（toll-like receptor）激活的類漿細(xì)胞、單核細(xì)胞衍生的樹突狀細(xì)胞、激活的B細(xì)胞，都一定程度地表達(dá)LLT1，對NK細(xì)胞有抑制作用，但對T細(xì)胞具有激活作用。 圖3A，CD161在粒細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞中高表達(dá)，主要在淋巴組織表達(dá)，摘自bgee.org。 圖3B，CD161的表達(dá)情況，分別在患者的上皮組織內(nèi)淋巴細(xì)胞（灰）、肝淋巴細(xì)胞（白）、外周血淋巴細(xì)胞，分別是大約75%、60%、20%。其中，上皮組織內(nèi)的CD3+CD161+陽性的天然T細(xì)胞，顯著高于CD3-CD161+的NK細(xì)胞。 圖3B，LLT1在小腸的派爾淋巴結(jié)高表達(dá)，主要在淋巴節(jié)和粒細(xì)胞表達(dá)，摘自bgee.org。 ? ? ? ?CD161和LLT1的信號(hào)通路 ? ? ? ?CD161在NK細(xì)胞上，作為抑制型受體，通過與其配體LLT1（CLEC2D）的結(jié)合，抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，抑制IFN-γ的釋放（圖4A）。也有研究表明，在T細(xì)胞上，尤其是Th17上，CD161可作為其細(xì)胞亞群標(biāo)記，為激活型受體，激活Th17表達(dá)和分泌IL-17（圖4B）。也可以通過TCR信號(hào)通路激活T細(xì)胞，促進(jìn)IFN-γ的釋放。 圖4A，NK細(xì)胞機(jī)制。LLT1表達(dá)在特殊的腫瘤組織中，比如三陰性乳腺癌（TNBC）、前列腺癌、B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞。表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面的LLT1，與NK細(xì)胞表達(dá)的CD161結(jié)合，給出抑制信號(hào)，降低其細(xì)胞毒性。LLT1在部分腫瘤組織中高表達(dá)，以抑制NK細(xì)胞的殺傷。 圖4B，T細(xì)胞機(jī)制。神經(jīng)磷脂酶（ASM），調(diào)節(jié)CD39和CD161的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，并促使Th17的增殖。在Th17分化條件下，CD4+ T細(xì)胞內(nèi)，MHC/CD3/CD28，以及IL-6的刺激信號(hào)，激活mTOR和STAT3信號(hào)。同時(shí)，CD39和CD161的刺激信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)了上述信號(hào)，最終導(dǎo)致Th17增殖，以及分泌IL-17。 ? ? ? ?CD161的胞內(nèi)區(qū)并沒有NK細(xì)胞受體常見結(jié)構(gòu)域的ITIM，即“免疫受體中基于酪氨酸的抑制型模體”，或ITAM，激活性模體。因此，CD161激活后的下游信號(hào)，不同于常見的NK細(xì)胞受體激活模式，并且在NK、T細(xì)胞中可能產(chǎn)生了不同的結(jié)果：一方面，胞內(nèi)域通過與CD39的結(jié)合，激活神經(jīng)磷脂酶（ASM、SMPD1），通過STAT3、mTOR等通路，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的表達(dá)；另一方面，激活A(yù)KT1/PKB和RPS6KA1/RSK1激酶和下游信號(hào)，這與通過CD3激活T細(xì)胞的通路一致。 ? ? ? ?研究表明，CD161的表達(dá)，受IL-12調(diào)控，依賴于IL-12作用時(shí)間和劑量。IL-12可提高NK細(xì)胞表面的CD161，進(jìn)而抑制NK細(xì)胞活性，這是一個(gè)負(fù)反饋的過程。另一方面，IFN-β可導(dǎo)致CD161表達(dá)降低。? ? ? ? ?CD161和LLT1的結(jié)構(gòu)和修飾 ? ? ? ?CD161是一種二型的穿膜糖蛋白，存在3對鏈內(nèi)二硫鍵，以及1個(gè)N糖基化位點(diǎn)（圖5）。 ? ? ? ?LLT1也是一種二型的穿膜糖蛋白，存在2對鏈內(nèi)二硫鍵，以及2個(gè)N糖基化位點(diǎn)（圖5）。 ? ? ? ?二型的穿膜蛋白，即N端為胞內(nèi)域，C端為胞外域。 
 
圖5 CD161的結(jié)構(gòu)信息，摘自Uniprot.org。CD161全長為225個(gè)氨基酸，保外域?yàn)?7~225，其中含有3對鏈內(nèi)二硫鍵，并存在1個(gè)N糖基化位點(diǎn)。 
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圖6 LLT1的結(jié)構(gòu)信息，摘自Uniprot.org。LLT1全長為191個(gè)氨基酸，保外域?yàn)?03~184，其中含有2對鏈內(nèi)二硫鍵，并存在2個(gè)N糖基化位點(diǎn)。 ? ? ? ?考慮到如果我們篩選一種阻斷CD161-LLT1結(jié)合的抗體，N糖基化如果影響了表位的構(gòu)象，那么抗體的結(jié)合也會(huì)受到N糖基化的影響。如果付諸于行動(dòng)，這個(gè)修飾的問題是無法繞開的。
二、迷失自我的狂歡 ? ? ? ?從CD161在NK細(xì)胞上的調(diào)控模式看，存在順式作用（NK細(xì)胞能在某種刺激條件下，同時(shí)表達(dá)CD161和LLT1，抑制自身活性）、反式作用（B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞表達(dá)LLT1，從而抑制NK細(xì)胞）。阻斷CD161-LLT1的結(jié)合，可以增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，釋放IFN-γ。 ? ? ? ?另一方面，CD161+CD8+的T細(xì)胞，被分類為組織追蹤MAIT（粘膜相關(guān)不變T細(xì)胞），細(xì)胞毒性Tc17細(xì)胞，或者記憶T細(xì)胞，具有組織追蹤和增強(qiáng)的細(xì)胞毒性。記憶細(xì)胞可以對病毒感染、細(xì)菌感染、抗原呈遞細(xì)胞的刺激做出響應(yīng)，進(jìn)而上調(diào)細(xì)胞因子，比如INF-γ、IL-17，釋放顆粒酶。 ? ? ? ?利用NK細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)機(jī)制，對NK細(xì)胞的抑制解除，以及激活，是一種新的免疫治療的前沿。我在之前的文章（https://mp.weixin.qq.com/s/5bWB41CAyKXi0348XTtIHw），總結(jié)了NK細(xì)胞作為免疫治療的新方向，列舉了一些NK細(xì)胞的激活或抑制型受體。比如激活型的KIR2DS、NKp80、NKp46/44/30、NKG2C/D/E、DNAM-1、CD16a，抑制型的KIR3DL、NKG2A/CD94、CD161/LLT1、PD-1、TIGIT、CD96、LAG3等（圖7、8）。 圖7 NK細(xì)胞表面的抑制型受體（紅）和激活型受體（綠）。ITIM，immuno-receptor tyrosine-based inhibitory motifs，免疫受體中基于酪氨酸的抑制型模體；ITAM，immuno-receptor tyrosine-based activation motifs，免疫受體中基于酪氨酸的激活型模體。KIR，killer Ig-like receptor，殺手細(xì)胞類免疫球蛋白受體。 圖8 NK細(xì)胞受體的分類。在NK細(xì)胞上，順式結(jié)合的CD161和LLT1，與MHC-I結(jié)合，抑制其活性。 ? ? ? ?NK細(xì)胞，占PBMC的5~10%，與CD8+ T細(xì)胞，有類似的殺傷活性（cytotoxicity），但是細(xì)胞的標(biāo)記物與CD8+ T細(xì)胞有顯著差異，不表達(dá)CD3和TCR。NK細(xì)胞的抗原特征為CD56+CD3-，其中85%~95%的NK細(xì)胞為CD56dim（暗）CD16ahigh，主要是成熟的殺傷細(xì)胞，高表達(dá)KIR，可分泌穿孔素和顆粒酶，剩余的為CD56bright（亮）CD16alow，有未成熟的NK細(xì)胞，低表達(dá)KIR和NKG2A/CD94。NK細(xì)胞的分類中，還包括抗原呈遞NK（APNK）、輔助NK（NKh）、調(diào)節(jié)NK（NKreg）。 ? ? ? ?與T細(xì)胞需要抗原呈遞的過程不同，細(xì)胞毒性NK細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的一部分，不需要抗原呈遞，組織相容性復(fù)合體（MHC）I類復(fù)合體與NK細(xì)胞結(jié)合，通常激活抑制型的受體（含ITIM，圖7），抑制了NK細(xì)胞的活性，這也是組織細(xì)胞避免被NK細(xì)胞殺傷的機(jī)制。在一部分腫瘤組織中，腫瘤細(xì)胞雖然下調(diào)了MHC-I的表達(dá)，規(guī)避了T細(xì)胞的識(shí)別，但因?yàn)镸HC下調(diào)激活了NK細(xì)胞的活性，補(bǔ)充了T細(xì)胞的不足。 ? ? ? ?NK細(xì)胞的殺傷機(jī)制，稱為“missing self”，即“迷失自我”。也有研究表明，MHC-I可激活NK細(xì)胞（圖8）。因此，NK細(xì)胞的殺傷活性，基于抑制和激活信號(hào)的平衡。 ? ? ? ?因此，如果不考慮腫瘤內(nèi)環(huán)境的惡劣、腫瘤細(xì)胞對NK細(xì)胞的塑造、調(diào)節(jié)型細(xì)胞的抑制的話，類比NKG2A/CD94，我們也可以將CD161/LLT1加入到這一場NK細(xì)胞“迷失自我的狂歡”中。目前，關(guān)于NK細(xì)胞的抗體（BiKE、TriKE），或者CAR-NK的臨床實(shí)驗(yàn)，也在如火如荼進(jìn)行中，也可以給我們一些借鑒。 ? ? ? ?然而，我們不能過于樂觀地估計(jì)NK細(xì)胞的殺傷，除了血液淋巴瘤，還有腫瘤微環(huán)境的巨大挑戰(zhàn)： ? ? ? ?1. 抑制信號(hào)，包括抑制型受體介導(dǎo)的（圖7、8），以及抑制型細(xì)胞因子，比如TGFβ、IL-10； ? ? ? ?2. 抑制細(xì)胞，Treg、NKreg、骨髓瘤衍生抑制型細(xì)胞（MDSC）、基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞；比如，Treg細(xì)胞、MDSC細(xì)胞表達(dá)TGFβ，結(jié)合NK細(xì)胞的TGFR2，從而下調(diào)其表面的NKG2D、NKp30這些激活型受體，使其被激活的能力降低； ? ? ? ?3. 浸潤能力，在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中，未檢測到NK細(xì)胞亞群，但是存在CD161+CD4+、CD161+CD8+的T細(xì)胞。在結(jié)直腸癌中，幾乎完全排除NK細(xì)胞的浸潤； ? ? ? ?4. 腫瘤微環(huán)境中，缺氧、低糖，顆粒酶B的半衰期顯著降低。 ? ? ? ?我們可以通過IL-12、IL-15、IL-18，是NK細(xì)胞聚集在腫瘤組織并維持活性。然而，IL-12促進(jìn)CD161的表達(dá)，進(jìn)而抑制NK細(xì)胞的活性。IL-15具有促進(jìn)NK細(xì)胞增殖和殺傷活性的能力，但是單獨(dú)使用，并不能維持NK細(xì)胞的滲透能力。
三、小結(jié) ? ? ? ?本期推送，我們給大家介紹了CD161和LLT1，并且講述了CD161在NK細(xì)胞上的調(diào)控模式以及腫瘤微環(huán)境的巨大挑戰(zhàn)。下一期中，我們會(huì)接著帶來CD161成藥性的挑戰(zhàn)以及CD161在T細(xì)胞尤其是CD8+的T細(xì)胞的病理機(jī)制。 |
